(1) 实验前准备。包括纯化重组蛋白及合成DNA探针。(2) 标记探针。在合成的DNA探针上标记放射性同位素32P或生物素。由于生物素不具有放射性以及便于操作等优点, 近年来人们常使用生物素标记DNA探针。按照以下顺序配制标记组和竞争组的反应体系。标记组: 12.5 μL超纯水, 5 μL5×
TdT缓冲液, 2.5 μL 1 μmol∙L–1未标记的Oligo, 2.5μL 5 μmol∙L–1 Biotin-11-UTP,
2.5 μL 2U∙μL–1 Diluted TdT。竞争组: 20 μL超纯水, 2.5μL
10×结合缓冲液(含Mg2 ),
2.5 μL 50 μmol∙L–1未标记的Oligo。37°C避光孵育30分钟。加入1.25 μL
0.2 mol∙L–1 EDTA终止反应, 然后加入25 μL氯仿:异戊醇(1:1), 旋涡振荡混匀, 16000 ×g离心1–2分钟, 取上清。随后转移至90°C孵育2分钟, 缓慢降温至60°C, 最后于60°C孵育30分钟。(3) 6%
TBE凝胶制备及预电泳。按照配方依次加入各成分并充分混匀, 注意在灌胶过程中要防止气泡的产生。待TBE凝胶完全凝固后开始预电泳, 90 V电泳1–2小时, 电泳缓冲液为0.5× TBE缓冲液。(4) 蛋白与探针结合反应。按照以下配方配制结合反应体系。实验组: 50 ng融合蛋白,
0.5–2μL标记探针, 6 μL结合反应缓冲液, 用超纯水定容至20 μL。竞争组: 50 ng融合蛋白,
0.5–2μL标记探针, 过量的野生型未标记探针或突变型未标记探针, 6 μL结合反应缓冲液, 用超纯水定容至20 μL。其中, 结合缓冲液的配方为:2 μL 10×结合缓冲液,
1 μL 50%丙三醇, 1 μL100 mmol∙L–1 MgCl2,1 μL
1 μg∙μL–1 Poly dI:dC, 1 μL 1% NP-40。 通常未标记野生型或突变型探针的用量为标记探针的10倍、50倍和100倍。Poly dI:dC可抑制蛋白与DNA的非特异性结合, 避免形成假复合物。(5) 电泳。结合反应完毕后加入5 μL上样缓冲液, 充分混匀再进行上样。电压90
V, 待指示剂到达胶的3/4处时即可停止电泳。(6) 转膜。将尼龙膜小心取出, 放入0.5× TBE转膜缓冲液中, 依次按照黑面-纤维垫-2层滤纸-胶-尼龙膜-2层滤纸-纤维垫-白面的顺序放置,注意不要有气泡产生。380 mA工作60分钟。(7) 紫外交联。取出尼龙膜用吸水纸吸干水, 蛋白面朝下放入紫外交联仪中, 紫外交联15分钟。(8) 发光检测。将紫外交联后的尼龙膜置于干净的平皿中, 加入10 mL封闭缓冲液, 轻柔摇动15分钟。轻轻倒掉封闭缓冲液, 加入8 mL结合/封闭缓冲液, 轻柔摇动15分钟。将尼龙膜转移至新的平皿中, 加入10 mL 1×漂洗液, 轻柔漂洗5分钟, 重复漂洗3次。将尼龙膜转移至新的平皿中, 加入15 mL底物平衡缓冲液, 轻柔摇动15分钟。取出尼龙膜, 吸干多余的底物平衡缓冲液, 置于新的平皿中。加入6 mL化学发光底物至完全覆盖尼龙膜, 静置孵育5分钟。最后, 取出尼龙膜, 从侧面吸干多余的化学发光底物, 用保鲜膜包被, 在化学发光成像系统(Bio-step)中曝光5分钟进行显影。(9)数据分析。通常情况下, 可以从两方面分析EMSA数据, 即底部的自由探针和位于上方的迁移条带(蛋白-DNA复合物)。在加入等量标记探针的前提下, 当蛋白与DNA产生互作时, 底部的自由探针减少, 迁移条带亮度增强。在此基础上增加未标记野生型探针会与标记探针竞争蛋白, 此时自由探针条带强度基本不变, 迁移条带亮度减弱; 而当增加未标记的突变探针时, 由于蛋白不结合该序列,突变探针不与标记探针竞争, 此时自由探针减少, 迁移条带亮度增强(Jiang
et al., 2016)。
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