GST-Pull down是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一，乌鲁木齐GST-pull down公司_银川GST-pull down实验_西安淳风生物科技有限公司，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用。目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）。结合物洗脱后，通过蛋白质印迹(WB)分析证实了两种蛋白质之间的相互作用。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”都可以通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录和翻译系统获得，这种方法简单易操作。实验操作流程如下：

1. 诱导与转化：

将制备好的分别带GST和His标签的质粒转化至BL21感受态细胞中

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A.质粒加入细菌

B.冰上30min

C. 42℃水浴5s或1min

D.向转化混合物中加入500µL LB，不加抗生素，160 rpm 37 ℃摇床振荡1h

E.涂板隔夜培养；pGEX用A板，pET用K板

F.挑选阳性克隆（引物根据自己做的质粒选择）

G.将阳性克隆加入至3 mL LB培养液，220 rpm 37 ℃过夜小摇

H.取200 µL菌液加入20 mL LB培养液（50 mL离心管内），1:1000分别加入氨苄西林（pGEX）及卡那霉素（pET-28a）220 rpm 37 ℃ 4-6小时

I.菌液呈浑浊状后检测OD值，OD值0.6时加入0.5 mM的IPTG，继续摇菌4小时

J. 5000 rpm离心10min后收集菌体，去除上清

2. 裂解细菌：

A.向菌体中加入1 mL含1x蛋白酶抑制剂的BC100缓冲液（不含Triton X-100）重新悬浮细菌。

B.将步骤A中的菌体悬液转移至1.5 mL EP管中，置于冰上。超声裂解细菌，超声30秒，冰上静置30秒，共反复5次。

C.超声后加入110 µL 10% Triton X-100, 4 ℃震荡1h。

D. 4 ℃，12000 rpm离心30分钟。收集上清液。

E.取20 µL上清，加入loading buffer，煮蛋白后SDS凝胶电泳，以考马斯亮兰染色检测蛋白表达。留40 µL裂解液作为input。

3. GST融合蛋白的纯化：

A.清洗beads:用含0.1% Triton X-100的BC100缓冲液洗20 µL GST-sepharose beads，5000 rpm离心30秒2次，乌鲁木齐GST-pull down公司_GST-pull down实验_西安淳风生物科技有限公司，共清洗3次。

B.重悬beads:以BC100缓冲液1：1重悬GST-sepharose beads。

C.孵育蛋白：将GST融合蛋白裂解液加入洗涤后的GST-sepharose beads中。4 ℃震荡孵育1小时。

D.收集beads: 5000 rpm离心30秒，两次，沉淀beads。

E.清洗beads:吸出上清，用1 mL BC500缓冲液（含1% Triton X-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads 3次。5000 rpm离心30秒，两次，沉淀beads。

F.清洗beads:以1 mL BC100缓冲液（含0.1% Triton X-100，不含蛋白酶抑制剂）清洗beads 3次。5000 rpm离心30秒，两次，沉淀beads

G.以300 µL BC100缓冲液重悬beads（含0.1% Triton X-100）。

4. His融合蛋白的纯化：

采用His-tagged protein purification Magbeads（Absin,中国）进行His融合蛋白的纯化，按照制造商的使用说明进行操作。

A.取0.3 mL的磁珠，磁性分离，washing buffer清洗3次。

B.细菌裂解液加入磁珠中，4 ℃震荡孵育1小时，乌鲁木齐GST-pull down公司_广州GST-pull down实验_西安淳风生物科技有限公司，washing buffer清洗3次，每次清洗后均磁性分离磁珠。

C.在磁珠中加入400 µL Elution buffer，室温震荡2分钟，磁性分离收集洗液。反复3次。

D.将3次中收集到的液体用10K的超滤管进行浓缩，5000 g，离心15分钟，加入500 µL BC100缓冲液进行缓冲液置换，5000g，离心15分钟，收集到50-100 µL浓缩蛋白。

5. 蛋白结合及检测：

A.纯化蛋白结合：向GST及GST-DNMT3L beads中分别加入10 µL His-USP46纯化蛋白，4 ℃震荡孵育1小时，5000 rpm离心30秒，两次，沉淀beads。

B.吸出上清。以1 mL BC100缓冲液（含0.1% Triton X-100）清洗beads 3次。

C.加入1 x loading buffer 50 µL，连同input样本，95 ℃金属浴5 min。离心分离beads，取上清进行Western blot检测。

▼背景说明 蛋白互作在细胞生命活动中起着关键作用, 在不同时空层面上参与多种细胞过程, 因此研究蛋白互作对于理解分子调控网络至关重要。通常情况下, 利用酵母双杂交系统筛选植物蛋白互作必须利用体外和体内系统进行验证。Pull-down就是验证植物蛋白互作的常用技术，被广泛用于体外验证蛋白间的直接互作。 ▼应用场景 Pull-down 技术, 也叫蛋白质体外结合实验, 是一种行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。 ▼实验原理 将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽标记的珠子上, 作为与目的蛋白亲和的支撑物, 充当“诱饵蛋白”, 目的蛋白溶液与之孵育, 可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白), 洗脱结合物后通过 SDS-PAGE 电泳分析, 从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白, 诱饵蛋白和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。在Pull-down 实验中, 设计恰当的对照实验非常重要, 该对照可以是表达有GST (非诱饵融合蛋白)的转化细胞裂解物, 也可以是将 GST 加到非转化细胞的裂解物中。 GST 融合蛋白 Pull-down 的方法可以用来鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质, 也可以鉴定2个已知蛋白质之间是否存在相互作用。此方法简单易行, 操作方便。但Pull-down 的结果并不能真实的反应蛋白质之间的相互作用, 因为在活体内它们不一定在亚细胞空间上能碰到, 所以并不意味着在生理条件下一定结合。 （1） 将表达GST融合蛋白（实验组）和GST（对照组）的质粒分别转入BL21菌株中。 （2） 分别挑取阳性单克隆于3ml含有抗生素的LB液体培养基中，37度，200转，过夜培养。 （3） 将过夜培养的3ml菌液接入300ml（1:100）含有抗生素的LB液体培养基中，37度，200转，2.5-3h，摇至OD600=0.8左右。 （4） 取出0.5ml菌液于4度保存作为诱导前菌液。 （5） 同时在剩余菌液中加入终浓度为1mM/L的IPTG，16-27度，100-200转，诱导8-16h。 （6） 诱导后取出0.5 mL 菌液于4°C 保存作为诱导后菌液; （7） 4°C, 6 000 rpm, 离心15 分钟, 收集诱导后菌体, 用20 mL PBS 溶液重悬菌体后, 转移至50 mL 离心管中; （8） 4°C, 6 000 rpm, 10 分钟, 倒掉上清, 液氮速冻, –80°C 保存用于纯化; （9） 4°C, 10 000 rpm, 2 分钟, 收集诱导前菌液和诱导后菌液, 用80 μL1XSDS 上样缓冲液重悬菌体; （10） 100°C, 煮沸样品5 分钟, 12 000 rpm, 离心2 分钟, 取上清对诱导结果进行SDS-PAGE 检测。 50% GST Sepharose 4B slurry的准备 （11） 将原75% Glutathione Sepharose 4B slurry 弹至均匀; （12） 取677 μL 原液/管, 3 000 rpm, 离心5 分钟, 弃上清; （13） 加500 μLPBS, 颠倒混匀, 3 000 rpm, 离心5 分钟, 弃上清, 反复5 次; （14） 加500 μLPBS, 颠倒混匀, 配成50% Glutathione Sepharose 4B 备用。 100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 5.1.3 GST融合蛋白的纯化 （15） 从–80°C 冰箱中拿出冻存的样品, 冰浴溶解菌体后, 加入4 mL PBS 和40 μL PMSF(100 mmol.L–1)和40 μL 蛋白酶抑制剂Cocktail (100X)进行充分重悬;（还有这种做法：每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）） 细胞裂解需要采用温和的裂解条件（问下天地人和细胞裂解液配方GST的）。为了不破坏细胞内存在的蛋白与蛋白之间的相互作用, 多采用非离子变性剂(NP-40 或Triton X-100), 不能采用高浓度的变性剂(0.2% SDS),细胞裂解液中要添加各种酶的抑制剂。 （16） 超声破碎, 频率: 100~200 瓦; 超声40 秒, 停止20 秒, 共5 次(菌体由浑浊变为澄清); （17） 4°C, 15 000 rpm 离心40 分钟; （18） 冰上转移细胞裂解液上清至洁净的10 mL 离心管中; （19） 在细胞裂解液上清中加入50 μL 50% Glutathione Sepharose 4B, 4°C, 静音混合器上温和旋转孵育30–60 分钟; （20） 3 000 rpm 离心5 分钟, 弃上清, 此时Sepharose 上即结合了GST融合蛋白或GST; （21） 在管中加入预冷的500 μL PBS (沿壁加入, 动作轻柔, 以免打断珠子与蛋白的联接), 轻晃悬浮珠子, 将Sepharose 洗涤1 次, 3 000 rpm 离心3 分钟, 弃上清; （22） 反复用PBS 洗涤3 次(最后用小枪吸净珠子表面水膜), 即获得结合有GST 融合蛋白或GST 的Sepharose, 用大口径的移液枪头转移至1.5 mL 尖底离心管中; （23） 如果用于检测, 在Sepharose 加入15–20 μL1xSDS 蛋白上样缓冲液, 在沸水中煮3分钟, 12 000 rpm 离心1 分钟, 取上清作SDS-PAGE 电泳; （24） 如果用于Pull-down 检测, 继续后续操作。

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