基本原理

在验证植物蛋白互作时，荧光素酶互补实验 (Luciferase Complementation Assay, LCA) 因其高灵敏度、可定量化、操作简单高效被广泛应用于植物学和动物学蛋白质互作研究

 

目前, 应用广泛的荧火素酶基因来源于北美萤火虫 (firefly luciferase), 该基因编码550个氨基酸组成的荧火素酶蛋白 (大小为62 kDa)。

实验中, 荧光素酶蛋白被切成N端和C端2个功能片段, 即NLuc (2–416AA)和 CLuc (398–550AA)。

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在一个实验体系中, 待检测的2个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合, 如果2个目标蛋白相互作用, 则荧火素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装, 从而发挥荧火素酶活性, 即分解底物产生荧光 。

Abstract:

Protein-Protein interactions play important roles in various eukaryotic biological processes. Compared to other techniques measuring protein-protein interactions in plants, the Luciferase Complementation Assay (LCA), based on Agrobacterium-mediated transient expression in Nicotiana benthamiana, is a sensitive, reliable, highly quantitative and low background method that can be easily scaled up for high-throughput interactome studies. Here, we describe a protocol that includes two alternative data collection methods to qualitative and quantitative analyse luminescence or luminous intensity to detect protein-protein interactions in plant cells.

实验过程 将含有融合蛋白的植物表达载体转化农杆菌 (Agrobacterium) 后注射烟草叶片。24–48小时后，成都荧光素酶互补技术服务_南昌荧光素酶互补技术服务_西安淳风生物科技有限公司，加入反应底物荧火素, 利用植物活体分子影像系统 (CCD imaging system) 或luminometer来定性定量检测荧光强度, 以判定目标蛋白之间是否存在相互作用及互作的程度。 操作步骤： 1. 载体构建：将两个蛋白质分别与 M-NLUC 和 M-CLUC 融合连接。 2. 抽提质粒。 3. 农杆菌转化。 4.侵染烟草，测量发出荧光的信号值并拍照，计算荧光素酶相对活性，判断蛋白质之间是否互作。 一、实验原理： 来自萤火虫的荧光素酶可以分成 N 和 C 两段蛋白质而没有酶活，将 N 和 C 端各融合另外的两个蛋白质，如果这两个蛋白质在体内可以互作的话，那么荧光素的N 和 C 端将在空间上靠近而恢复酶活，因此可以通过检测分段的荧光素酶可否恢复酶活而判断两个蛋白质之间在体内是否存在相互作用。 二、实验目的： 检测蛋白质之间的体内相互作用。 三、操作步骤： 1. 载体构建：将两个蛋白质分别与 M-NLUC 和 M-CLUC 融合连接。 2. 抽提质粒。 3. 农杆菌转化。 4.侵染烟草，测量发出荧光的信号值并拍照，计算荧光素酶相对活性，判断蛋白质之间是否互作。 注意事项： 1. 本实验必须要设计严谨的对照。连有目的基因的载体必须分别和另外一个空 载体共转化，同时需要两个空载体之间共转化，以排除背景信号的影响。同 时可以转化一对确定互作的蛋白质来评价系统的有效性。 2. 必须共转一个恒定表达的别的报告基因（如 GUS 何来自海参的荧光素酶 REN）来平衡化各个转化之间的系统误差和转化效率。 3. 高纯度的质粒和高效的原生质体转化体系是保证实验成功的关键所在。 4. 可以将相关元件连接改造到可以进行农杆菌介导的转化的载体上去，从而可 以在体内稳定检测蛋白质之间的相互作用。 一、 原理 利用农杆菌将外源基因导入烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作和蛋白纯化等实验操作。 二、 材料与试剂 携带表达载体的农杆菌菌株，2-4周的烟草植株，LB培养基，100mM乙酰丁香酮，0.5M MES（ph5.6），10mM MgCl2，恒温摇床，一次性注射器，分光光度计，成都荧光素酶互补技术服务_广州荧光素酶互补实验外包_西安淳风生物科技有限公司，Amp抗生素 三、 实验步骤 1. 挑取单克隆于1 ml LB液体培养中，28~30°C震荡培养24小时。通常，LB中加入100 ug/ml 利福平（农杆菌株GV3101携带抗性），成都荧光素酶互补技术服务_西宁荧光素酶互补实验_西安淳风生物科技有限公司，200 ug/ml 卡那霉素（载体携带）。 2. 将1 ml 过夜培养的农杆菌转接到25 ml LB液体培养基中（加有与1相同的抗生素）。另外加入2ul 100mM的乙酰丁香酮和100ul 0.5M MES，28度摇床培养OD值约1.0左右。 3. 4000rpm常温离心10min，15分钟收集菌体。 4. 用含10mM MgCl2重悬菌体至OD值为1.0，以每毫升菌液加入2ul100mM AS，静置3小时以上。 5. 取正处于生长期的烟草叶片，使用针头在叶片反面扎些小孔。 6. 将侵染液装入5 ml 注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。因为本实验为验证实验，注射前需将组合农杆菌进行混合。 7. 注射后72小时，取样通过荧光素酶检测试剂盒检测荧光信号。 试剂: 原生质体转化相关试剂（参阅拟南芥或者水稻原生质体转化相关章节） 萤火虫荧光素酶底物（Promega, Luciferase Assay System）

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