基本原理
在验证植物蛋白互作时,荧光素酶互补实验 (Luciferase Complementation Assay, LCA) 因其高灵敏度、可定量化、操作简单高效被广泛应用于植物学和动物学蛋白质互作研究
目前, 应用广泛的荧火素酶基因来源于北美萤火虫 (firefly luciferase), 该基因编码550个氨基酸组成的荧火素酶蛋白 (大小为62 kDa)。
实验中, 荧光素酶蛋白被切成N端和C端2个功能片段, 即NLuc (2–416AA)和 CLuc (398–550AA)。
在一个实验体系中, 待检测的2个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合, 如果2个目标蛋白相互作用, 则荧火素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装, 从而发挥荧火素酶活性, 即分解底物产生荧光 。
Abstract:
Protein-Protein interactions play important roles in various eukaryotic biological processes. Compared to other techniques measuring protein-protein interactions in plants, the Luciferase Complementation Assay (LCA), based on Agrobacterium-mediated transient expression in Nicotiana benthamiana, is a sensitive, reliable, highly quantitative and low background method that can be easily scaled up for high-throughput interactome studies. Here, we describe a protocol that includes two alternative data collection methods to qualitative and quantitative analyse luminescence or luminous intensity to detect protein-protein interactions in plant cells.
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2020-03-05